葡萄糖促进母猪发情表现

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后备母猪是指从出生到发情生理阶段的母猪,该阶段母猪对养殖业具有非常重要的作用,其繁殖性能直接关乎养殖场的发展和经济效益。近些年,我国后备母猪面临发情率低、配种率低等问题,高淘汰率和低繁殖性能消耗大量的人力、物力、财力,严重威胁生猪产业的健康发展[1-2],提高后备母猪的繁殖性能成为目前育种工作者研究的热点。

胰岛素对母猪的繁殖性能有很大影响,日粮能量等能够通过胰岛素经早期生长应答基因-1( Egr-1) 、胞外信号调节激酶( ERK) 和神经肽Y( NPY) 等途径作用于垂体,提高促性腺激素释放激素( GnRH) 、促黄体素( LH) 和卵泡刺激素( FSH) 等的分泌,这些激素作用于卵巢,促进雌激素( E2) 和孕激素( P) 的合成与释放,进而促进卵泡发育,对母畜的发情、受孕、胚胎发育、仔畜初生质量、断奶质量等繁殖性状具有重要影响[3-4]。研究表明,胰岛素分泌不足而患有糖尿病的后备母猪,其卵泡闭锁率较高[5]。在初情期前,外源胰岛素处理能够减少小母猪的卵泡闭锁率[6]。刘岩等[7]使用不同质量浓度胰岛素刺激猪的颗粒细胞,随着胰岛素质量浓度增加,颗粒细胞的数目及其分泌的雌激素量明显升高,当胰岛素的质量浓度达到10 ng /mL 时,颗粒细胞分泌雌激素的质量浓度达到最大。由此可见,胰岛素对于母猪的卵泡发育具有重要作用。

研究证实,铬能够通过提高母猪机体对胰岛素的敏感性影响其繁殖性能,在生产中通过给初产母猪补饲铬调节其繁殖性能,如吡啶羧酸铬[8]、烟酸铬[9]、蛋氨酸铬[10]、皮革蛋白粉[11]等。然而,铬作为重金属元素,会促进血液中部分蛋白质沉淀,引发贫血、肾炎、神经炎、呼吸道炎症等疾病,长期接触甚至诱发肺癌等。因此,寻找其他物质代替铬元素促进母猪胰岛素的分泌是亟需解决的问题。大量研究表明,葡萄糖是参与调控胰岛β细胞合成分泌胰岛素最为重要的调节物质,一方面葡萄糖从转录、转录后以及翻译3 个水平促进胰岛素基因的表达量,此外葡萄糖通过第二信使途径等诱导胰岛β细胞分泌胰岛素[12-14]。与铬相比,葡萄糖既安全又易获取,但能否将其作为铬的替代物来调控母猪繁殖性能的研究尚未见报道。为此,本研究通过在饲料中添加葡萄糖诱导母猪胰岛素分泌,检测其血清繁殖相关激素含量的变化,同时通过实时定量PCR技术检测其繁殖相关基因表达量的变化,验证葡萄糖对胰岛素的诱导作用以及葡萄糖通过胰岛素对母猪繁殖性状的影响。

1、材料和方法

1. 1 供试动物及样品采集

选取6 头70 ~ 80 kg 大约克后备母猪( 河南农科种猪科技有限公司),每头猪具有同样的遗传背景。将6 头猪随机分为2 组,其中一组为试验组,饲料中添加200 g /d 剂量的葡萄糖[15],每天3 次,促进其体内胰岛素的分泌。另一组作为对照组。所有供试猪严格按照商品猪的饲养规程饲养。饲喂3 周后进行屠宰试验,屠宰前停饲24 h。屠宰前抽取每头猪20 mL静脉血,4℃、3 000 r /min 离心15 min,分离得到的血清立即冻于液氮中待测激素含量。屠宰后30 min内采集每头猪的子宫组织,样品剪成黄豆大小,立即冻存于液氮中待测其繁殖相关基因表达量。

1. 2 试剂

葡萄糖以及实时定量PCR所用引物购自生工生物工程( 上海) 股份有限公司; 胰岛素、雌激素、孕激素酶联免疫检测试剂盒购自北京北方生物技术研究所有限公司; TRIZOL 试剂和PrimeScriptTM RT -PCR试剂盒购自英杰生命技术有限公司; SYBRPremix Ex Taq Ⅱ试剂盒购自宝生物工程( 大连) 有限公司。

1. 3 仪器设备

冷冻离心机和PCR仪购自艾本德股份公司; 紫外分光光度计购自Implen公司; 实时定量PCR仪购自罗氏公司。

1. 4 激素水平测定

按照试剂盒说明书使用酶联免疫分析血清中的胰岛素、雌激素和孕酮含量。

1. 5 总RNA 的提取及cDNA 的合成

使用TRIZOL 试剂提取子宫组织的总RNA,通过1%琼脂糖凝胶电泳检测所提RNA的质量,然后使用紫外分光光度计检测所提RNA 的浓度。稀释为同一浓度后,使用PrimeScriptTM RT -PCR试剂盒合成cDNA。

1. 6 实时定量PCR检测繁殖相关基因表达变化

根据GenBank 数据库的相关基因信息,使用PrimerPremier 5. 0 软件设计实时定量分析的引物,包括雌激素受体( estrogen receptor 1,ESR) 、骨桥蛋白( osteopontin,OPN) 、视黄醇结合蛋白4 ( retinolbinding protein 4,RBP4) 、黄体生成素受体(luteinizinghormone receptor,LHR) 、孕激素受体( progesteronereceptor,PGR ) 、KISS1 受体( KISS1 receptor,GPR54) 等6 个繁殖性状相关的基因,具体引物信息见表1。使用SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒进行定量PCR分析。扩增体系包含cDNA 2 μg,上、下游引物( 10 μmol /L) 各1 μL,2 × SYBR Ex TaqⅡ12. 5 μL。扩增程序为: 94 ℃ 3 min; 95 ℃ 10 s, 60 ℃ 30 s,40个循环。

1. 7 统计分析

使用SPSS 统计分析软件完成激素和基因表达差异的显著性检测,结果用平均值±标准误来表示。

2、结果与分析

2.1 添加葡萄糖对相关激素的影响

添加葡萄糖极显著改变胰岛素、雌激素和孕酮的表达量( 表2) 。与对照组相比,试验组胰岛素上调了4.76 倍,孕酮表达量变化最大,上调了4.93倍,雌激素上调倍数最低,为1. 74 倍。

2.2 添加葡萄糖对繁殖相关基因表达量的影响

添加葡萄糖对所选的6 个繁殖相关基因的表达量均有影响,与对照组相比,仅LHR基因表达量下调( 试验组和对照组差异不显著) ,ESR、OPN、GPR54、PGR和RBP4 基因表达量均上调。其中,ESR表达量变化最大,添加葡萄糖其表达量上调5. 056倍( P < 0. 01) ,RBP4 基因上调倍数最少,上调2. 108 倍( P < 0. 05) ( 图1) 。

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